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白念珠菌基因多态性与耐药性关系

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             作者:黄静, 刘慧, 朱家馨, 周宇麒, 谈淑卿, 张天托 

【摘要】     【目的】 探讨耐氟康唑白念珠菌基因多态性与其耐药性是否相关。【 方法 】 收集48株敏感白念珠菌和10株耐氟康唑白念珠菌,其中包括2株体外诱导的耐氟康唑白念珠菌。选择1个随机引物(引物1251),采用任意引物PCR方法基因分型,将电泳图谱扫描入 计算 机后采用Labwork4.0软件转化为数值图表,利用SPSS 11.5进行聚类 分析 。 【结果】 引物1251的PCR指纹图带型稳定,多态性丰富,可以作为分型引物。聚类分析结果提示8株临床耐药菌的PCR指纹图相似系数为71.7%,而其中7株的耐药菌相似系数高达86.7%,远高于58株菌的平均相似系数(47.3%)。2株体外诱导的耐药菌诱导前后基因型未发生变化。【结论】 基因分型的结果未提示耐氟康唑白念珠菌存在一定的特殊电泳条带,但提示了特定的PCR指纹图可能与耐药性有一定相关性。

【关键词】   白念珠菌; 基因型; 氟康唑; 耐药性,任意引物PCR

    Abstract:  【Objectives】  To investigate the possible relationship of C. albicans gene polymorphisms and its fluconazole-resistance.  【Method】 Forty-Eight fluconazole-susceptible stains and 10 fluconazole-resistant stains of C. albicans were analyzed, with two resistant stains induced in vitro. All of them were genotyped by arbitrary primed polymerase chain reaction (AP-PCR) fingerprinting employing one interrepeat primes (1251 primers). The image was captured using computer-assisted system with Labwork 4.0 software to analyze the gel patterns of all isolates. The data were processed by SPSS 11.5 statistical software. 【Results】  Primer 1251 was suitable for fingerprinting analysis, and was found to generate the reproducible fingerprinting profiles, yielding well-resolved banding patterns. The AP-PCR profiles of 8 resistant stains isolated clinically were highly similar according to similarity coefficient (71.7%). Furthermore, the similarity coefficient of 7 resistant isolates (86.6%) was significantly higher than that of total 58 stains (47.3%). For two induced isolates, their genotypes did not change much after resistance-inducement in vitro. 【Conclusions】  No specific DNA profiles of C.albicans indicating fluconazole-resistance were identified. However , our results demonstrated a strong genetic correlation between fluconazole-resistant patterns and its AP-PCR profiles in C.albicans.

    Key words: C.albicans; genotype; fluconazole; drug resistance; AP-PCR

      近年来随着免疫抑制剂、抗肿瘤药物、广谱抗生素的 应用 及艾滋病流行,临床上因白念珠菌感染所致的深部真菌病逐年增多,而过多、广泛的使用抗真菌药物所产生的选择压力,使念珠菌的耐药现象有明显增多的趋势。白念珠菌的耐药表型与基因型的关系 目前 仍不清楚,寻找一种恰当的基因分型方法,探讨其与耐药表型的关系,对监测耐药株的分子流行病学,以及深化耐药分子机制的 研究 有重要的临床意义[1]。我们应用任意引物PCR(Arbitary primed -PCR)的方法对临床分离的白念珠菌进行了基因分型,研究白念珠菌的耐药性与基因多态性的关系。

    1   材料与方法

    1.1   受试菌株

    8株耐氟康唑白念珠菌(MIC>64 μg/mL),分别从近两年我院8名器官移植术后和骨髓移植术后患者的痰液中和深静脉导管黏附物中分离得到。同期选择了47株对氟康唑敏感的白念珠菌,均从我院患者的痰液、血液、静脉导管拭子等分离培养得到。2株为我们利用体外氟康唑诱导后产生耐药性白念珠菌(m90028,m113)另有1株标准的白念珠菌为ATCC90028,为我科实验室保存。

    1.2   药物敏感性测定

    氟康唑纸片扩散法初筛试验采用2002年美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)认可的酵母菌纸片扩散法敏感试验方法,对58株白念珠菌进行了氟康唑初筛实验。采用Etest法测定耐药菌株对常用抗真菌药的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)。进行MIC测定的菌株为已经氟康唑纸片扩散法测定判为耐药菌株。E test试纸条为瑞典AB.Biodisk公司出品,包括氟康唑(fluconazole) 0.016~256 μg/mL、二性霉素B (amphotericin B) 0.002~32 μg/mL、5-氟胞嘧啶(5-Fu) 0.002~32 μg/mL、酮康唑(ketoconazole) 0.002~32 μg/mL、伊曲康唑(itroconazole) 0.002~32 μg/mL。将5种E test试纸条按不同角度紧贴于培养基上,35 ℃温箱孵育24~48 h,根据抑菌环大小判读MIC值。质控标准:以白念珠菌ATCC90028为质控株。对氟康唑MIC>64 μg/mL为耐药株。

    1.3   白念珠菌DNA的提取

    取保存在牛奶管中的菌种,分别划线转种至沙氏培养基上,35 ℃孵育24 h后,取分离开的新鲜单菌落溶于YEPG液体培养基中,35 ℃振荡培养24 h。DNA提取采用酶破壁和酚氯仿抽提方法。

    1.4   AP-PCR反应

    根据 文献 [10]选择了1条寡核甘酸引物:引物1251(被称之为真核细胞内重复序列)作为AP-PCR分型的随机引物(由上海生物工程公司合成),序列为5′-TGG GTG TGT GGG TGT GTG GGT GTG-3′。AP-PCR反应体系:PCR Premix 25 μL(含TaKaRa Taq 1.25 U,dNTPs各0.4 mmol/mL,Mg2+ 3 mmol/mL),白念DNA模板3 μL,Primer F 1 μL(20 μmol/μL),Primer B 1 μL(20 μmol/μL),ddH2O 20 μL,反应终体积50 μL。AP-PCR反应参数如下:94 ℃预变性3 min,前5个循环为94 ℃变性30 s,35 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min;后40个循环为94 ℃变性1 min,52 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min;最后72 ℃延伸10 min。

    1.5   PCR产物电泳及分析

    以DNA分子量100 bp DNA ladder plus marker为分子量标准,PCR产物在含0.5 μg/mL溴乙啶的2 g/L琼脂糖中电泳后,用凝胶成像系统观察结果并将其经荧光扫描处理后输入计算机,根据电泳条带的位置,荧光的强弱,经Labwork 4.0软件处理后转化为数值图表,以电泳图谱的条带数目、位置以及PCR产量的相对大小作为统计变量,应用SPPSS11.5软件对58株白念珠菌的PCR指纹图谱进行聚类分析。本研究利用相似系数评价菌株之间的关系。AP-PCR实验重复2次。

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