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阴虚内热证红斑狼疮外周血单一核细胞BCL-2基因家族动态研究

来源:  作者:赖梅生,范瑞强  [字体: ]

【摘要】     目的研究激素+滋阴清热方 治疗 前、中、后阴虚内热证红斑狼疮(SLE)外周血单一核细胞(PBMC)凋亡相关BCL-2基因家族的动态表达。方法阴虚内热证SLE患者治疗前、中、后三次及健康对照组外周血单一核细胞基因表达谱芯片检测,对BCL-2基因家族成员数据进行分析。结果找到BCL-2基因家族基因16个,其中BCL-2、BAG3治疗前、中、后均明显下调,而BAG1、BCL6、BCLA21治疗后表达均上调。结论 阴虚内热证SLE患者PBMC存在BCL-2基因家族凋亡基因的异常,激素与滋阴清热方治疗后抑制/促进凋亡的BCL-2基因比例发生明显改变,细胞凋亡减少。BCL6可能是中医药等治疗SLE的靶基因之一。提示研究不同证型SLE治疗前后T、B淋巴细胞亚型的凋亡情况及凋亡机制,是合理评价凋亡在SLE发病及诊治中的作用的关键。凋亡基因的调控可能是滋阴清热方实现阴平阳秘的内在机制之一,有待深入研究。

【关键词】   阴虚内热证; 系统性红斑狼疮(SLE);BCL-2; 细胞凋亡

  Abstract:ObjectiveTo study the dynamic expression of the apoptosis-associated BCL-2 gene family in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of the heat deficiency patients with lupus erythematosus (SLE) before, during and after treatment with hormone and Ziyin Qingre formula. MethodsBefore, during and after treatment, peripheral blood mononuclear cells of the SLE patients with “Yin” asthenia generating intrinsic heat were separated,then cDNA microarray chip was used to analyze and compard with a healthy control group,in this part, the data of BCL-2 gene family members were selected out and analyzed.Results16 BCL-2 family gene were found. The expression of BCL-2 and BAG3 were significantly reduced before, during and after treatment, while the expression of BAG1, BCL6 and BCLA21 was increased after treatment.ConclusionAbnormalities of BCL-2 family gene in PBMC of SLE patients with “Yin” deficiency heat were observed. Apoptosis suppression and promotion gene of BCL-2 family were changed by the hormones and Ziyin Qingre formula treatment which led to reducing apoptosis. BCL6 may be one of the target gene which was affected by the treatment of Chinese medicine. To study the different subtypes apoptosis and apoptosis mechanisms of T and B lymphocyte of SLE with different syndrome pattern before and after treatment is very important for  estimation on the role of apoptosis in SLE pathogenesis, diagnosis and treatment. Regulation of apoptotic genes may be one of the mechanisms of Ziyin Qingre formula to achieve "Yin" and "Yang" in a relative equilibrium.

  Key words:"Yin" asthenia generating intrinsic heat;   Systematic lupus erythematosus (SLE);   BCL-2;   Apoptosis
   
  SLE是多基因相关的自身免疫性系统性疾病,发病与细胞异常凋亡密切相关。BCL-2/Bax是诱导细胞凋亡的通路之一。Bax是BCL-2癌基因家族中能够促进细胞凋亡的蛋白,BCL-2是能够抑制细胞凋亡的蛋白,两者的比值决定细胞凋亡与否,当Bax多时,细胞凋亡,否则凋亡延缓[1]。BCL基因家族中其它基因也与细胞凋亡密切相关。阴虚内热证是SLE的最常见最基本的证型。广东省中 医院 皮肤科多年应用滋阴清热方治疗阴虚内热证SLE取得良好效果,我们研究阴虚内热证SLE中医药治疗后BCL基因家族表达的动态变化,试图从基因水平探讨其 现代 分子机制。

   1  临床资料

    轻中度(5≤SLEDAI≤25)阴虚内热证SLE患者从2005-11~2006-11在广东省中医院门诊就诊的女性患者(年龄在18~50岁之间)中纳入,总共纳入18例,其中退出2例,失访1例,有效病例共15例。健康对照组来自于健康志愿者,共15例。阴虚内热证SLE患者15例,最大48岁,最小18岁,平均年龄:(31.60±9.37);健康对照组15例,均为女性,最大42岁,最小18岁,平均年龄:(28.4±6.50)。两组年龄经两样本t检验,方差齐性(F=2.929,P=0.098),差异无统计学意义(t=1.087,P=0.289)。纳入、排除、剔除、退出标准详见赖梅生博士 论文 [2]。

   2   研究方法

  2.1   治疗方法

  2.1.1  中药治疗滋阴清热方(狼疮Ⅱ号),5粒/次,3次/d口服。 部分病人阴虚内热症候比较明显时,短期配合使用滋阴清热方汤剂,加强滋阴清热功效。

  2.1.2  一般治疗及对症处理保护胃粘膜、补钾、补钙、抗感染。西医药除激素外,只根据患者激素用量配合使用泰胃美、雷尼替丁保护胃粘膜。

  2.1.3  激素治疗所有病例均维持纳入时的激素用量,最高不超过25mg。疗程3个月。

  2.2  表达谱基因芯片实验方法分别于治疗前、治疗中(6周)和治疗后(12周)采静脉血分离提取淋巴细胞,然后按基因芯片技术要求提取总RNA,-70℃保存备用,按完成3个月疗程的先后顺序送检9例患者的27个样本和10例正常人样本,其中4例患者至少有一次样本不符合基因芯片实验要求,最后选择了3次样本均合格的5例患者的15个样本及正常对照组10个样本,首先对样品进行体外扩增处理,随后对扩增后的RNA样品采用反转录标记方法掺入CY3荧光分子,每个样品完成一张GS芯片(人类基因表达谱芯片由微芯生物公司采用cDNA直接点样生产,共点有8 064个基因点,其中7 458个为表达基因片段)实验。

  2.3  数据处理与统计分析比值(Ratio)表示荧光信号通过LOWESS方法归一化后,基因表达量在实验组(对照组)和对照组(实验组)间的变化倍数(大于1的数值代表相应基因表达量上调的倍数,小于1的数值则代表相应基因表达量下调,其倍数则用1除以该数值后的负数来表示)。按两个样品信号强度间的比值(Ratio)大于2或小于0.5的数据作为表达有显著性差异的基因数据。用SPSS13.0软件将16个BCL基因家族成员基因前、中、后3次表达与正常人的表达的比值(Ratio)进行重复测量方差分析和多元方差分析,两两比较用SNK法。

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