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牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化(二)

来源:  作者:梁平  [字体: ]

  5)金属螯合亲和层析用于蛋白质的复性

  在基因工程技术中,表达的重组蛋白多以包涵体形式存在,蛋白质经常会错误折叠而丧失活性,这一难题长久以来都没有得到很好的解决。高浓度的变性剂可以溶解包涵体,然后控制变性剂除去的速度,有时需要添加适当的氧化/还原试剂,蛋白质可以逐步折叠复性。通常使用的复性方法有三种,分别是稀释复性、透析复性和层析复性。

  (1)稀释复性:直接把溶解的蛋白质稀释于复性缓冲液中。这种方法操作简单,适于小规模使用,但只适于浓度极低的蛋白质复性,否则会有大量聚集体形成。

  (2)透析复性:采用透析膜通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度。这种方法速度慢、耗时长,不适合大规模使用,有时易形成无活性蛋白聚集体。

  (3)层析复性:使蛋白质可逆吸附在固相介质上,例如离子交换层析介质、金属螯合亲和层析介质等,可以避免伸展的多肽分子之间形成聚集体。金属螯合亲和层析(IMAC)是一种有效的纯化和复性蛋白质的层析方法。在高浓度变性剂存在的情况下,组氨酸尾仍旧具有吸附在金属螯合亲和层析介质上的能力,所以可在IMAC介质上同时实现复性与纯化[112-116]。蛋白质吸附在IMAC介质后,先逐步降低变性剂的浓度,使蛋白质折叠,然后提高咪唑浓度把折叠后的蛋白质洗脱出来。对于TNF蛋白,使用IMAC获得了90%的复性收率[73]。

  2.6 小结
  大肠杆菌系统由于其遗传学、生物化学和分子生物学方面已充分被人们了解而成为表达许多异源蛋白质的首选表达系统。在过去的20多年中,用各种载体系统在大肠杆菌中表达了数百种重组蛋白。融合标签不但可提高重组蛋白的产量,还可增强重组蛋白质的可溶性。融合标签技术的 发展 使重组蛋白质的纯化更加快速、简便。随着金属螯合亲和层析技术的不断发展和改进,目前,固定化金属螯合亲和层析技术已成为蛋白质,特别是基因重组蛋白和多肽分离纯化最有效的工具之一。

  本课题组已成功构建了Pg菌毛蛋白fimA基因的原核表达质粒pET-15b-fimA,本研究在此基础上,拟将此质粒在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达,然后用固定化金属螯合亲和层析技术得到纯化的FimA蛋白,为下一步获取免疫血清、进一步研制具有实用价值的预防牙周炎的免疫疫苗提供实验基础。


  3 实验一  fimA在大肠杆菌中的表达

  3.1 实验材料与仪器

  3.1.1 菌珠

  1)大肠杆菌BL21(DE3)pLysS:北京天根生化科技有限公司。该菌株基因型为:F-,ompT,hsdSB(rB-mB-),dcm(DE3),gal,pLysS,Cam r,该菌珠所带pLysS具有氯霉素抗性。此质粒含有表达T7溶菌酶的基因,T7溶菌酶能降低目的基因的背景表达水平,但不干扰IPTG诱导的表达。适于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。

  2)携带有pET-15b Vector和pET-15b-fimA的大肠杆菌TOP10(本课题组前期实验获得)。其中pET-15b Vector:原核表达载体,双链环状DNA,由5708 bp组成,含有可插入外源基因的多克隆位点(MCS)、Amp抗性基因、T7 lac、T7 promoter、lac operator、T7 terminator、N-末端His-Tag(6个组氨酸)。是一种组氨酸融合表达载体,这6个组氨酸标签便于用钴柱纯化或以抗组氨酸抗体筛选。pET-15b载体读框及多克隆位点见图3.1,其克隆、表达区见图3.2。


            图3.1  原核表达载体质粒pET-15b图谱


           图3.2  pET-15b载体克隆、表达区

  3.1.2 主要试剂
  1)DNA Marker VI:北京天为时代科技有限公司

  2)预染蛋白质MarkerⅢ:北京天根生化科技有限公司

  3)细菌LB培养基(胰蛋白胨、酵母提取物):Promega公司

  4)琼脂糖(Agarose):上海生工生物技术有限公司

  5)琼脂粉(Agar powder):上海化学试剂公司

  6)脱氧胆酸钠:上海亚培生物科技有限公司

  7)丙烯酰胺、双丙烯酰胺、四甲基二乙胺(TEMED)、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、Tris碱、甘氨酸、溴酚蓝:Amresco USA

  8)考马斯亮蓝(Brilliant Blue R-250):上海绿岛科技发展有限公司分装

  9)ECL底物化学发光试剂盒:Pierce Biotechnology USA

  10)质粒小提试剂盒:北京天为时代科技有限公司

  11)硝酸纤维素膜(NC膜):浙江省台州市四甲生化厂

  12)一抗(Anti-his antibody,小鼠单克隆抗体IgG2b):北京天根生化科技有限公司

  13)二抗(Goat anti-Mouse IgG,(H+L),Perpxidase Conjugated):Pierce Biotechnology USA

  14)脱脂奶粉:完达山乳业股份有限公司

  15)其他生化试剂如溴化乙锭(EB)、冰醋酸、甲醇、过硫酸铵、无水乙醇、NaCl、CaCl2、MgCl2、氨苄青霉素、氯霉素等,均为进口或国产试剂

  3.1.3 实验仪器
  1)自动双重纯水蒸馏器SZ-93:上海亚荣生化仪器厂

  2)超纯水设备Elix3+Mil-GB:法国Millipore公司

  3) 电子 分析天平AA-250:Denver Instrument Company

  4)恒温磁力搅拌器78HW-1:杭州仪表电机厂

  5)电热恒温干燥箱PH030:上海市实验仪器厂有限公司

  6)数控超声波清洗器KQ-500DE型:昆山市超声仪器有限公司

  7)全自动高压灭菌锅HV-50:日本HIRAYAMA

  8)塑料薄膜封口机SG-200型:上海凯明电子机械有限公司

9)紫外线消毒灯ZSZ:北京海淀空后高温复合材料厂

  10)生物型洁净工作台BCM-1000A:苏净集团安泰公司

  11)微量移液器Research单道/多道:Eppendorf

  12)恒温培养箱HH.B11.420-BS:上海安亭

  13)大型摇床QYC-211:上海福马实验设备有限公司

  14)空气浴震荡器HZQ-C:哈尔滨市东明医疗器械厂

  15)离心机(台式低速)TDL-40B:上海安亭 科学 仪器厂

  16)离心机Sigma1-15(台式高速)和Sigma3K18(台式高速冷冻):Sigma

  17)离心机(超微型)E-Centrifuge:Wealtec公司

  18)微量振荡器ZW-A:江苏常州国华电器有限公司

  19)石英定时器SDD-2型:北京市长风仪器仪表公司

  20)电子恒温水浴锅DK-98-1:天津市泰斯特有限公司

  21)精密DRY BLOCK加热器HGT24:T&D

  22)酸度计420A:Thermo Orion

  23)核酸电泳仪EPS-301:Amersham Biosciences

  24)电泳槽DYCP-31D:北京六一

  25)紫外可见光分光光度计Ultrospec 3300:Amersham Biosciences

  26)凝胶成像系统Dolphin-Doc:Wealtec公司

  27)台式电脑:联想

  28)扫描仪ScanMaker 5900:中晶科技

  29)冷冻干燥系统Lyph-Lock 12 Liter:Laboconco公司

  30)普通冰箱NR-B22S1:无锡松下冷机有限公司

  31)低温冰箱925型:Forma Scientific

  32)STD3101-1蛋白电泳仪:Amersham Biosciences

  33)Hoefer MiniVE Vertical Electrophoresis System:Amershem Biosciences USA

  3.2 实验方法

   3.2.1 从大肠杆菌Top10中提取质粒pET15b与pET-15b-fimA

  从-70℃ 冰箱中取出携带有pET-15b和pET-15b-fimA的大肠杆菌TOP10菌珠,将细菌分别划线涂布于含Amp(100 μg/ml)的LB固体培养基平板上,倒置平板,37℃培养12~16 h后出现菌落。

  从培养平板中挑选氨苄青霉素抗性菌落,分别接种入5m1 LB培养基中(含Amp l00 μg/m1),37℃ 振荡培养16 h,质粒小提试剂盒分别提取质粒DNA。步骤如下:

  1)4℃,12000 r/min离心OD值超过0.6的菌液2ml,弃掉上清,倒扣在滤纸上流尽残余的上清。

  2)加250 μl溶液P1,充分振荡混匀至彻底悬浮。

  3)加250 μl溶液P2,温和的上下翻转6~8次使菌体充分裂解。此时菌液变得清亮粘稠,所用时间不应超过5 min。

  4)加350 μl溶液P3,温和的上下翻转6~8次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀,4℃,12000 r/min离心10 min,收集离心后得到的上清。

  5)将上一步所得的上清加入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中),12000 r/min离心30 s,弃去收集管中的废液。

  6)加500 μl去蛋白液PD,12000 r/min离心30 s,弃掉废液。

  7)加700 μl漂洗液PW(已加入无水乙醇),12000 r/min离心30 s,弃掉废液。

  8)加500 μl漂洗液PW,12000 r/min离心30 s,弃掉废液。

  9)将吸附柱CB3放回收集管中,12000 r/min离心2 min,尽量除去漂洗液。

  10)取出吸附柱CB3,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100 μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65~70℃水浴预热),室温放置15 min,12000 r/min离心1 min。将1.5 ml离心管(DNA溶液)于-70℃保存。

  取5 µl质粒DNA,10 g/L TBE琼脂糖凝胶80 V、40 mA电泳检测DNA。设立marker对照。待溴酚蓝迁移至理想位置后,终止电泳,在紫外灯下观察拍照。

  3.2.2 E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞的制备
  采用低温CaCl2制备感受态细胞的方法制备大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞。步骤如下:

  1)从37℃培养16~20 h的平板上挑取一个单菌落(直径2~3 mm),转到一个含有50 ml LB液体培养基的250 ml锥形瓶中,37℃,220 r/min振摇培养3 ~4 h,至A600大约为0.6。

  2)将细菌转移到一个高压灭菌、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中,在冰上放置10 min,使培养物冷却至0℃。

  3)4℃,4100 r/min离心10 min,以回收细胞。

  4)倒出培养液,将管倒置1 min使最后的痕量培养液流尽。

  5)用30 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2 ,20 mmol/L CaCl2)重悬细胞沉淀。

  6)4℃,4100 r/min离心10 min,以回收细胞。

  7)倒出培养液,将管倒置1 min使最后的痕量培养液流尽。

  8)用2 ml冰预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重悬细胞沉淀。

  9)加入高压灭菌后的50%甘油,配成含甘油20%~25%的悬液,分装100 µl/支于eppendorf管中,-70℃冻存。

  3.2.3 空质粒和重组质粒转化E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞
  1)制备含Amp(50 µg/m1)的15 g/L琼脂-LB固体培养基平板。

  2)取冻存于-70℃的E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞在流水下快速解冻(不可震动)。

  3)将提取的空质粒和重组质粒各10 µl分别加入两支感受态细胞中,轻轻吹打混匀。

  4)冰浴30 min后,置预热后的精密水浴锅42℃热休克90 s,立即移入冰水中放置2 min。

  5)分别加入37℃预热后的LB液体培养基(不含抗生素)500 µl,37℃摇床150 r/min温和振摇60 min,使细胞复苏。

  6)将离心管内容物混匀,分别吸取100 µl 已转化的感受态细胞加到两个含Amp(50 µg/m1)的15 g/L琼脂-LB固体培养基平板上,用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。

  7)将平板置于室温直至液体被吸收,倒置平板,37℃培养12~16 h。

  3.2.4 从E.coli BL21(DE3)pLysS中提取质粒pET15b和pET-15b-fimA
  从培养平板中挑选氨苄青霉素抗性菌落,分别接种入5 m1 LB培养基中(含Amp l00 μg/m1),37℃振荡培养16h,质粒小提试剂盒分别提取质粒DNA。步骤如3.2.1中所示。

  取5 µl质粒DNA,10 g/L TBE琼脂糖凝胶80 V、40 mA电泳检测DNA。设立marker对照。待溴酚蓝迁移至理想位置后,终止电泳,在紫外灯下观察拍照。

  3.2.5 重组质粒pET-15b-fimA在E.coli BL21(DE3)pLysS内的诱导表达
  在转化了质粒pET15b和pET-15b-fimA的LB固体培养基上,各挑取一单克隆菌落,分别接种入1 ml Amp+(50 μg/ml)的LB液体培养基中,37℃,250 r/min振摇过夜。用LB培养基1:100稀释过夜菌(50 μl:5 ml),37℃剧烈振荡培养2 h,待菌液浓度达A5500.6~0.8时,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),诱导的IPTG终浓度和诱导时间成梯度改变,以摸索最佳诱导条件:

  A管:pET-15b-fimA,1 ml,加入IPTG致终浓度为2 mmol/L,30℃振摇3 h;

  B管:pET-15b-fimA,1 ml,加入IPTG致终浓度为2 mmol/L,30℃振摇2 h;

  C管:pET-15b-fimA,1 ml,加入IPTG致终浓度为2 mmol/L,30℃振摇1 h;

  D管:pET-15b-fimA,1 ml,加入IPTG致终浓度为1 mmol/L,30℃振摇3 h;

  E管:pET-15b-fimA,1 ml,加入IPTG致终浓度为1 mmol/L,30℃振摇2 h;

  E管:pET-15b-fimA,1 ml,加入IPTG致终浓度为1 mmol/L,30℃振摇1 h;

  F管:pET-15b,1 ml,加入IPTG致终浓度为2 mmol/L,30℃振摇3 h;

  以上7个菌种管中菌液置于EP管中,4℃,12000 r/min离心5 min收集细菌沉淀,弃去上清;向沉淀中加入等体积的水和2×Loading buffer(SDS凝胶加样缓冲液),重悬后煮沸10 min,离心8 min;

  取上清进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。

  SDS-PAGE:配制12%分离胶和5%浓缩胶,按Amersham Biosciences公司蛋白电泳系统说明书灌制凝胶。取上述样品,每孔30 μ1上样。电泳在恒压下进行,浓缩胶中为90 V,分离胶中为120 V。电泳结束后,凝胶右下角做切角标记,然后将凝胶放入表面皿,加入5倍体积的考马斯亮蓝染色液(考马斯亮蓝R250 1.0 g,甲醇450 ml,冰醋酸100 ml,蒸馏水450 ml),35℃摇床上染色3 h。染色完成后,加入脱色液(甲醇100 ml,冰醋酸100 ml,蒸馏水800 ml),35℃摇床上脱色至背景清晰,观察。

  3.2.6 蛋白免疫印迹(Western blot)鉴定蛋白的表达
  在转化了质粒pET15b和pET-15b-fimA的LB固体培养基上,各挑取一单克隆菌落,分别接种入1 ml Amp+(50 μg/ml)的LB液体培养基中,37℃,250 r/min振摇过夜。用LB培养基1:100稀释过夜菌(50 μl:5 ml),37℃剧烈振荡培养2 h,待菌液浓度达A5500.6~0.8时,加入IPTG:

  A管:pET-15b-fimA,1 ml,加入IPTG致终浓度为2 mmol/L,30℃振摇3 h;

  B管:pET-15b,1 ml,加入IPTG致终浓度为2 mmol/L,30℃振摇3 h;

  以上2个菌种管中菌液置于EP管中,4℃,12000 r/min离心5 min收集细菌沉淀,弃去上清;向沉淀中加入等体积的水和2×Loading buffer,重悬后煮沸10 min,离心8 min。

  取上清进行SDS-PAGE,电泳结束后将凝胶切取所需条带部分后进行Western blot,具体步骤如下:

  1)用转膜缓冲液平衡凝胶和硝酸纤维素膜(NC膜)30 min。

  2)铺膜:将海绵在转膜缓冲液中完全浸润铺于阴极板,上铺三层用转膜缓冲液浸湿的滤纸,铺凝胶,铺NC膜,再铺三层滤纸,每层均需完全清除气泡,上面铺两层海绵,合上转印盒,内加转膜缓冲液高于海绵。

  3)转印:电泳槽内加冰块,灌入转膜缓冲液,300 mA转印65 min。

  4) 封闭:转印结束后,将NC膜放入封闭液(10 g脱脂奶粉溶于100 ml TBST中,煮沸冷却)中,液面必须过膜,摇床上轻摇4 h,保证膜的所有部分同溶液接触。

  5)洗膜:弃去封闭液,TBST洗3次,每次15 min。

  6)一抗结合:按照抗体说明书,用TBST将抗His标签的抗体稀释2000倍,弃去TBST,将膜放入一个自封袋内加一抗(0.1 ml/cm2膜面积)排出气泡,封口,4℃冰箱过夜。

  7)洗膜:弃去一抗,TBST洗3次,每次15 min。

  8)二抗结合:按照抗体说明书,用TBST将HRP标记的山羊抗鼠IgG稀释2000倍,弃去TBST,将膜放入一个自封袋内加二抗(0.1 ml/cm2膜面积)排出气泡,37℃恒温箱孵育1小时。

  9)洗膜:弃去二抗,TBST洗3次,每次15 min。

  10)用吸水纸吸干膜上的水分。

  11)显色:按ECL底物化学发光试剂盒说明书配发光检测液,用吸管将配制的发光检测液转移到NC膜上,使其均匀覆盖,室温孵育5分钟。

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